活細胞DNA成像是指利用成像手段，對活細胞內的DNA序列進行標記和觀察?；罴毎鸇NA成像常用于檢測基因組DNA在細胞核內的定位分布和動態變化等特征，幫助人們了解這些特征與基因表達調控之間的關系，加深人們在基因組層面對細胞生命活動的認識。在醫療領域，活細胞DNA成像可以用來檢測細胞內基因組DNA的拷貝數，有助于21-三體綜合征等染色體異常相關疾病的診斷。

日前，中國科學院分子細胞科學卓越創新中心研究員陳玲玲團隊開發了一種活細胞DNA成像新工具。團隊篩選并優化了現有的基因編輯系統CRISPR-dCas12a，并基于此構建了新型DNA成像系統CRISPRdelight。這一新工具可用于活細胞內非重復DNA序列成像，為研究活細胞中DNA位點的空間位置和動力學特征提供了更加簡單便利的手段。相關研究論文在線發表于《自然·方法》雜志。

已有工具存在明顯局限

隨著能夠特異性靶向任意核酸序列的基因編輯系統CRISPR-Cas被開發出來，基于該系統的活細胞DNA成像工具也在不斷迭代更新。

“當前，活細胞DNA成像工具的種類已經十分豐富?！闭撐牡谝蛔髡摺⒅袊茖W院分子細胞科學卓越創新中心博士楊良中介紹，其中大部分工具都是從CRISPR/dCas9-EGFP系統衍生而來。這些已有的活細胞DNA成像工具分別從向導RNA的骨架結構和表達質粒構建方式等方面，對原始系統進行優化升級。

例如上?？萍即髮W研究員馬涵慧開發了DNA成像系統CRISPRainbow和CRISPR-Sirius，用于在活細胞中觀察基因組的三維結構，并示蹤它們的動態變化。前者創造性地在向導RNA骨架結構中引入了RNA適配體，用于標記DNA序列，并通過改變RNA適配體的類別，實現了不同DNA靶點的多色成像。后者則在此基礎上進一步做了優化，通過增加RNA適配體的數目來提高成像質量。北京大學教授陳匡時團隊開發的兩種DNA成像系統，則通過引入分子信標和熒光共振能量轉移成像方法來提高DNA成像信噪比，以提升成像清晰度。

“目前較為成熟的系統已經實現了活細胞內絕大部分重復DNA序列成像和多色成像，甚至在一定程度上實現了非重復DNA序列成像，但它們都存在明顯的局限性?！睏盍贾信e例說，比如一些系統，通過改進向導RNA表達質粒的構建方式，將多條向導RNA表達元件放到同一個質粒上，從而減少需要向細胞內遞送質粒的數目，增強成像效果。但將多個表達元件構建到一個質粒的方法步驟繁多、操作復雜，并不利于推廣使用。還有一些系統，通過將DNA的標記信號放大，實現一條向導RNA對目的序列的標記和成像。但僅利用一條向導RNA可能會存在標記脫靶的問題。

總而言之，在基于CRISPR/dCas9-EGFP的活細胞DNA成像工具中，利用一條向導RNA標記DNA往往信號太弱或容易脫靶，要實現特異性非重復DNA序列成像或多色成像，需要表達多條向導RNA，通過多個靶點DNA信號的富集作用，才能實現對目的非重復序列成像。而如果讓每個表達元件只表達一條向導RNA，就會增加向導RNA表達元件的數量，提高成像的復雜度，降低成像效率。“如何高效率、高質量實現非重復DNA序列成像，一直是活細胞DNA成像領域的一大挑戰?！?楊良中說。

新型系統更加簡便高效

與基于CRISPR/dCas9-EGFP的活細胞DNA成像工具不同，此次團隊開發的新工具是基于基因編輯系統CRISPR-dCas12a。這兩種系統都可以特異性靶向DNA，但CRISPR-dCas12a還能夠加工處理系統本身的CRISPR陣列，并生成成熟的向導RNA。

“我們開發的新型DNA成像系統CRISPRdelight正是利用了這一特點，通過表達一條能編碼多條向導RNA的轉錄本來進行成像，而非單獨轉錄每條向導RNA。”楊良中介紹，這樣既實現了對靶點DNA信號的富集放大，又避免了系統復雜度增加。而且這一條轉錄本不僅可以編碼靶向同一DNA位點的向導RNA，也可以同時編碼靶向不同位點的向導RNA，實現多位點多色成像。因此，新系統更加簡便高效，容易通過增加向導RNA的數目提高成像質量，大大降低了活細胞中非重復序列DNA成像的門檻。

與此同時，團隊利用新系統揭示了基因位點在細胞核內的定位與其運動能力和轉錄活性的相關性，還實現了對4種活細胞內衛星DNA的多位點多色成像。

由于新系統具有簡便易操作等特點，楊良中認為，該系統未來有望應用于需要進行活細胞DNA成像的實驗室，為活細胞中基因組DNA轉錄活性、DNA在細胞核內的定位分布和動態變化特征之間的關聯性，以及等位基因之間表達調控的異質性等研究提供助力，還能進一步幫助研究人員了解三維基因組在細胞核內高度組織化的分子機制及其功能意義等。

非重復DNA序列成像和多位點多色成像是活細胞DNA成像長期面臨的兩大難題。如今，新系統的出現基本解決了非重復DNA序列成像的問題，但在活細胞DNA多位點多色成像方面，新系統仍有改進空間?！氨M管我們通過在新系統中引入RNA適配體實現了多個重復DNA序列的多位點多色成像，但是RNA適配體的引入在一定程度上影響了系統對CRISPR陣列的加工能力?！睏盍贾姓f，要實現多個非重復DNA序列的標記追蹤，未來還需進一步對CRISPRdelight進行優化。